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Se casó en 1526 con Isabel de Portugal y de dicho matrimonio nacieron los siguientes hijos: Felipe II de España. María de Austria. Fernando. Juana de Austria. Juan. Juan, que nació un año después de morir el anterior Juan, y que al nacer provocó la muerte de su madre por complicaciones con el parto.
En total, Carlos V tuvo 12 hijos con su primera esposa Isabel de Portugal. Se casó una segunda vez en 1556 con su sobrina, María de Austria. Tuvieron una hija juntos, Margarita de Austria, nacida en 1559. En conjunto, Carlos V tuvo 13 hijos.
Como hijo de Felipe el Hermoso y Juana la Loca, llegó a manos de Carlos V una vasta y heterogénea herencia, en la que mucho tuvieron que ver la combinación de matrimonios dinásticos y una serie de muertes prematuras de los herederos directos de distintos tronos.
Hijo de Juana I de Castilla y Felipe el Hermoso, y nieto por vía paterna del emperador Maximiliano I de Habsburgo y María de Borgoña, de quienes heredó el patrimonio borgoñón y el Archiducado de Austria con el derecho al trono imperial del Sacro Imperio Romano Germánico, y por vía materna de los Reyes Católicos, Isabel I de Castilla y Fernando I...
Carlos V fue el primogénito de la infanta Juana la Loca (1479-1555), hija de los Reyes Católicos, y de Felipe el Hermoso (1478-1506) duque de Borgoña e hijo de Maximiliano I de Austria, emperador del Sacro Imperio Romano Germánico. Nació en Gante, capital del condado de Flandes, en 1500.
Carlos nació en el condado de Flandes, hijo de Felipe de Habsburgo (hijo de Maximiliano I de Habsburgo y María de Borgoña) y de Juana de Trastámara (hija de Isabel I de Castilla y Fernando II de Aragón, los Reyes Católicos de España). Heredero por excelencia de sus cuatro abuelos, Carlos heredó desde muy joven todos los dominios de su familia.
Carlos e Isabel, tuvieron un total de seis hijos: Felipe II de España: Su primogénito y heredero nació en Valladolid en 1527. Fue Rey de España desde 1556, de Nápoles y Sicilia desde 1554 y de Portugal y los Algarves desde 1580, realizando una ansiada unión dinástica con Portugal, que duró 60 años.
