Ya viuda, regresó a su tierra el 19 de agosto de 1561. Cuatro años más tarde, se casó con su primo hermano Enrique Estuardo, Lord Darnley, con quien, en junio de 1566, tuvo su único hijo, Jacobo. En febrero de 1567, la residencia de su consorte fue destruida por una explosión y Enrique fue encontrado asesinado en el jardín.
Jacobo fue el único hijo de María I Estuardo, reina de Escocia, y de su segundo marido Enrique Estuardo, Lord Darnley, duque de Albany, al que sus contemporáneos tildaban de atolondrado, cobarde y pretencioso.
El asesinato de Lord Darnley, en 1567, y las conspiraciones en que se vio envuelta la obligaron a abdicar a favor de su hijo de un año de edad, al mismo tiempo que la reina Isabel I la sometía a juicio y ordenaría su reclusión por 18 años, para ser ejecutada en 1587, por complicidad en un complot hispano para asesinar a la reina de Inglaterra.
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